PCR مراحل اجرای
مرحله شروع A
به مدت ۱ تا ۹ دقیقه دمای محلول به ۹۴ تا ۹۶ درجه (یا ۹۸ درجه اگر پلیمرازها کاملا به حرارت مقاوم باشند) رسانیده میشود. این مرحله فقط برای DNA پلیمرازهایی ضروری است که نیازمند فعال شدن توسط حرارت در روشhot-start PCR هستند.
مرحله واسرشت
این مرحله اولین قسمت از سیکل های حرارتی منظم است و شامل حرارت دادن محلول به مدت ۲۰ تا ۳۰ ثانیه در دمای ۹۴ تا ۹۸ درجه است. در این مرحله بعلت گسستن پیوندهای هیدروژنی (بین نوکلئوتیدها)، DNAی الگو و پرایمرها از هم جدا میشوند و تک رشته های DNA حاصل میگردد.
مرحله اتصال
دمای محلول به مدت ۲۰ تا ۴۰ ثانیه به ۵۰ تا ۶۵ درجه کاهش می یابد. در این مرحله پرایمرها به تک رشتهای DNAی الگو متصل میشوند. بطور طبیعی، دمای اتصال (Annealing temperature) در حدود ۳ الی ۵ درجه پائین تر از نقطه ذوب پرایمرها است. پیوندهای هیدروژنی پایدار فقط زمانی شکل میگیرد که سکانس پرایمر و رشته الگو مکمل یکدیگر باشند. آنزیم پلیمراز پس از اتصال به هیبرید پرایمر-الگو، همانند سازی DNA را آغاز میکند.
مرحله طویل شدن
دمای محلول در این مرحله باید متناسب با نوع DNA پلیمراز مورد استفاده باشد. دمای اپتیمم برای آنزیم Taq polymerase حدود ۷۵ الی ۸۰ درجه است که معمولا دمای ۷۲ درجه انتخاب میشود. در این مرحله آنزیمDNA پلیمراز با استفاده از dNTP های موجود در محلول، یک رشته DNAی جدید را در جهت َ۵ به َ۳ و در مقابل رشته های الگو میسازد.مدت زمان این مرحله نیز باید متناسب با نوع DNA پلیمراز و طول رشته DNA باشد. در دمای بهینه، DNA پلیمراز در هر دقیقه، یک هزار باز را پلیمریزه مینماید. در مرحله طویل شدن در صورت وجود سوبسترای کافی و تامین شرایط بهینه، مقدار DNA در محلول PCR دو برابر میشود. بنابر این در هر سیکل PCR، غلظت DNA بصورت تصاعدی افزایش می یابد.
مرحله طویل شدن نهایی
این مرحله، پس از آخرین سیکل PCR، به مدت ۵ الی ۱۵ دقیقه در دمای ۷۰ الی ۷۴ درجه انجام میشود، تا اطمینان حاصل شود که همه تک رشته های DNA همانند سازی شده اند.
نگهداری نهایی
در این مرحله، محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای ۴ الی ۱۵ درجه قابل نگهداری است.
الکتروفورز در ژل آگارز
نهایتا میتوان محصولات PCR را بر روی ژل آگارز و همراه با مارکر وزن مولکولی(DNA lader که حاوی قطعات DNA با اندازه های مشجص است) الکتروفورز نمود، تا صحت انجام PCR بررسی شود.
