PCR مقدمه ای بر

در بیولوژی مولکولی، واکنش زنجیره ای پلی مراز یا PCR، بمنظور تکثیر یک قطعه DNA مورد استفاده قرار میگیرد. تکنیک PCR در سال ۱۹۸۴ توسط کری مولیس (Kary Mullis) ارائه شده است. در این تکنیک، یک مولکول DNA میلیونها بار تکثیر میشود. تکثیر انتخابی یک ناحیه مورد نظر از یک مولکول DNAاست مثلا یک ژن ، توسط آنزیم DNA پلیمراز به دفعات زیاد است قسمتی از سکانس مولکول DNA که بین دو پرایمر قرار دارد توسط آنزیم پلیمراز در آزمایشگاه تکثیر (Amplify) میشود

در روش PCR سیکل های دمایی (Cycle) ایجاد میشود. در ابتدا با ایجاد حرارت و رساندن  دمای محلول  به نقطه ذوب DNA، دو رشته DNA از هم جدا میشوند. در مرحله بعد با کاهش دما یک آنزیم DNA پلیمراز فعال شده، عمل همانند سازی (Replication) را انجام میدهد. DNA پلیمراز آنزیمی است که با استفاده از نوکلئوتیدها (مصالح ساختمانیDNA)،  رشته الگو(DNAی مورد مطالعه) و یک قطعه پرایمر قادر به همانند سازی است.

صحت نتایج PCR بستگی به انتخاب پرایمر مناسب دارد. پرایمرها قطعات کوچک پلی نوکلئوتیدی هستند و در آزمایشگاه به گونه ای طراحی و سنتز شده اند که دارای سکانس نوکلئوتیدی مکمل با ناحیه َ۳ در  مولکول DNAی مورد نظر هستند. بنابر این بطور اختصاصی فقط به این مولکولها متصل شوند. چون آنزیم DNA پلیمراز به قطعات پرایمر متصل میشود، در نتیجه فقط مولکول DNAی هدف همانند سازی و تکثیر میگردد. با اعمال تغییرات دمایی بطور متوالی و برنامه ریزی شده، روند PCR تکرار گردیده و در هر مرحله DNA دو برابر میشود. بنابر این تعداد مولکولهای DNA بصورت تصاعدی و به نسبت n2 افزایش می یابد که n  تعداد سیکل های دمایی است. مثلا یک مولکول DNA، پس از ۲۰ سیکل به ۱٫۰۴۷٫۵۸۶ مولکول تکثیر میشود.

در مرحله همانند سازی، برای جدا نگهداشتن دو رشته DNA، باید دمای محلول بالا باشد. بنابر این از یک نوع آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت استفاده میشود. اولین آنزیمی که بدین منظور مورد استفاده قرار گرفت Taq polymerase بود که از باکتری ترموس آکواتیکوس(Thermus aquaticus) بدست می آید.

امروزه PCR بعنوان یک ابزار مهم در فعالیتهای تحقیقاتی و بالینی محسوب میشود. بعضی از کاربردهای PCR عبارتند از: کلونینگ DNA بمنظور تعیین توالی، فیلوژنی بر اساس DNA (آنالیزعملکردی ژنها)، تشخیص بیماریهای ارثی، انگشت نگاری ژنتیکی (در تعیین والدین و جرم شناسی) و تشخیص بیماریهای عفونی. در سال ۱۹۹۳ به پاس ابداع تکنیک PCR، جایزه نوبل به کری مولیس اهداء گردید.

PCR برای تکثیر بخشهای خاصی از مولکول DNA مورد استفاده قرار میگیرد. این بخشها ممکن است یک ژن کامل، قسمتی از یک ژن یا سکانسهای بین ژنها باشند. در بسیاری از روشهای PCR، قطعات DNAی هدف حداکثر ۱۰ کیلو جفت باز(kb) دارند. اگرچه در بعضی از روشهای خاص، قطعات بزرگتر حتی تا kb40 را هم میتوان تکثیر کرد. محلول PCR معمولا حاوی مواد زیر است:

  DNAی الگو: شامل DNAی هدف است که تکثیر میگردد.

  پرایمرهای Forward و Reverse : به گونه ای طراحی شده اند که هر یک مکمل ناحیه َ۳ در یکی از رشته های DNA باشد. پرایمر ها ی PCR بصورت کاملا” اختصاصی ومکمل ناحیه مورد نظرDNA هدف طراحی میگردند. پرایمرها 30-20 بازدارند و پرایمرهای بیش از 30 باز اختصاصیت خوبی ندارندنرم افزارهایی وجود دارد که طراحی پرایمر را انجام میدهند. بعد از طراحی پرایمر بهتر است تو سط نرم افزارهایی مانندBlast آنها را چک نمود تا مشخص شود که با چه ژنهای دیکر میتوانندAnneal گردند.

  Taq polymerase یا DNA پلیمراز دیگری که دمای بهینه اش در حدود ۷۰ درجه سانتیگراد باشد.

  دزوکسی نوکلئوزید تری فسفاتها (dNTPs): مصالح ساختمانی که توسط DNA پلیمراز برای ساختن رشته های DNAی جدید بکار میروند.

  محلول بافر: شرایط محیطی مناسبی را از نظر pH و یونهای مختلف ایجاد میکند تا پایداری DNA پلیمراز و فعالیت بهینه آن تامین شود.

  کاتیونهای دو ظرفیتی: یونهای منیزیم یا منگنز

  کاتیون یک ظرفیتی: یون پتاسیم

محلولPCR  معمولا به حجم ۱۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر در لوله های کوچک ۰٫۲ تا ۰٫۵ میلی لیتر تهیه میشود. این لوله هل در بلوکهای مخصوصی در دستگاه ترموسایکلر قرار داده میشوند. ترمو سایکلر، طبق برنامه ریزی انجام شده، دمای لوله ها را در زمانهای مشخصی افزایش و کاهش میدهد تا مراحل مختلف PCR انجام شود. برای جلوگیری از تبخیر محلول (و در نتیجه افزایش غلظت در بخشهای بالائی محلول)، معمولا یک لایه روغن بر سطح محلول قرار داده مبشود. ولی در دستگاه های جدیدتر از درپوش های حرارتی استفاده میشود.در روش PCR تغییرات دمائی(سیکل ها) بین ۲۰ تا ۴۰ بار تکرار میشود. تعداد سیکل ها با توجه به مقدار DNAی اولیه،  شرایط آزمایش و مقدار محصول مورد نیاز انتخاب میشود. دمای لوله ها و فواصل زمانی هم تابع عوامل مختلفی است از جمله: نقطه ذوب پرایمرها (Tm)، نوع DNA پلیمراز، غلظت یونهای دو ظرفیتی و غلظت dNTPها.

مرکز آموزش بیوانفورماتیک نصر

error: Content is protected !!
X