پپتیدها، و طراحی صنعتی آن به عنوان یک محصول قابل مصرف برای مصارف درمانی و خوراکی و صنعتی یکی از چالش بر انگیز ترین و پر سود ترین صنایع جهان است که بخش عمده ای از تجارت دارویی نوترکیب و تکنولوژی های وابسته به آن را تشکیل داده است در این مقاله به نکاتی تخصصی برای طراحی و بهینه سازی ساختاری و عملکردی این پپتیدها برای حل مشکلات تولید آن در صنعت می پردازیم .
سکانس یک پپتید مهمترین عامل موثر بر فعالیت زیستی آن است.توالی و ترکیب آمینواسیدی یک پپتید، همچنین بر نتیجه سنتز و خالص سازی و همینطور حلالیت آن نیز موثر است. برای یک پروژه پپتیدی موفق، عواملی مانند سهولت سنتز با کمترین هزینه و امکان بکارگیری پپتید برای کاربردهای مختلف بر حسب پایداری و حلالیت آن مهم است.
بیشتر پپتیدهای حال حاضر در بازار و تحقیقات بیولوژیکی از انتهای N، انتهای Cیا توالی میانی پروتئین‌های طبیعی مشتق شده اند. البته پپتیدها را می‌توانند بصورت de novo( از ابتدا) طراحی شوند. برای طراحی یک پپتید مناسب نکات بسیاری را باید رعایت کرد. در این مقاله به برخی نکات و تکنیک های اساسی بیوانفورماتیک کاربردی در طراحی پپتیدهای صنعتی پرداخته می شود.
طول سکانس پپتید:
طول سکانس پپتیدی از آنجایی حائز اهمیت می باشد که محدودیت طول توالی در حدود 10-15 باقی مانده برای افزایش بازده کلی در فرایندهای تولید عمده، خلوص، به حداقل رساندن ناخالصی و کاهش قیمت تمام شده ی پروژه ی سنتز پپتید موثر است. خلوص پپتیدهای سنتزی معمولا با افزایش طول توالی کاهش می‌یابد.
ساختمان دوم پپتید:
برخی از پپتیدها ساختمان دوم از نوع صفحات بتا را شکل می دهند. در طول سنتز تشکیل صفحه بتا به علت حلالیت ناقص پپتید در حال سنتز و تجمع آن سبب درجه بالای از حذف توالی در محصول نهایی می‌شود. برای جلوگیری از چنین موردی توالی های فاقد باقی مانده های متعدد و متوالی مانند والین، ایزولوسین، تیروزین، تریپتوفان، لوسین، گلایسین و ترئونین طراحی و جایگزاری می گردد. در صورتی که امکان چنین کاری نباشد، جایگزینی اسیدامینه صورت می گیرد و با قرار دادن گلایسین یا پرولین در هر سه باقی مانده انجام شود و یا جایگزینی گلایسین با آسپارژین و جایگزینی ترئونین با سرین.
تمایل باقیمانده‌های توالی پپتیدی برای انجام واکنش اکسیداسیون:
پپتیدهای دارای چندین باقیمانده Cys، Met یا Trp تمایل به انجام واکنش اکسیداسیون داشته و واکنش‌های جانبی اثر منفی بر حلالیت و خلوص پپتید دارد که منجر به افزایش هزینه ها و زمان فرایند خالص سازی می گردد. جلوگیری یا به حداقل رساندن چنین باقیمانده های در توالی یا جایگزینی با باقیماندهای جایگزین مشابه می‌تواند مفید واقع شود. بطور مثال نورلوسین می‌تواند به عنوان جایگزین برای Met ، و سرین یک جایگزین کمتر واکنش پذیر برای Cys است.
ترکیب آمینواسیدی:
نحوه ی قرارگیری و ترکیب کلیت آمینواسیدی یک پپتید اغلب در حین طراحی و بهینه سازی نادیده گرفته می‌شود. این ترکیب بر حلالیت نهایی، سنتز پپتید و خالص سازی تاثیر مستقیم و معنی دار خواهد گذاشت. حفظ مقدار آمینواسیدهای آبگریز (Leu، Val، Ile، Met، Phe، Trp و غیره) زیر 50 درصد و اطمینان از وجود حداقل یک اسید آمینه باردار به ازای هر 5 آمینواسید. جایگزینی Ala با Gly یا اضافه کردن باقیمانده های قطبی (چندین آرژنین، لایزین و PEG کوچک) به انتهای N و C حلالیت را بهبود می‌بخشد.
آمیداسیون و کلاهک گذاری در توالی پپتیدی:
برای سکانسهای داخلی برگرفته از پروتئین‌های طبیعی کلاهک برای انتهای N و C یا هر دو به منظور جلوگیری از باردار بودن که در توالی طبیعی وجود ندارد. انتهای C و N می‌توانند به صورت گروه آمیدی یا استیل به ترتیب بلوکه شوند.
تحوه ی قرار گیری آمینواسیدهای انتهای N:
در طی فرایند طراحی پپتیدی می بایست از قرار دادن گلوتامین در انتهای N اجتناب شود زیرا گلوتامین تحت شرایط اسیدی به پیروگلوتامات وارد واکنش کاتالیز میگردد. اما اگر که لازم است گلوتاماین در این جایگاه قرارگیرد، یک گروه استیل به گروه آمینو گلوتامین اضافه میگردید یا از پیروگلوتامات به جای آن در توالی استفاده شود. اجتناب از آسپارژین در انتهای N برای جلوگیری از ایجاد مشکل در طول برداشت گروه محافظ بعد از سنتز،ضروری می باشد
قرارگیری آمینواسید در انتهای C:
آمینواسیدهای نظیر سیستئین، پرولین و گلایسین میبایست در انتهای C به علت عوامل مختلفی مانند راسمیزاسیون، تشکیل دی پپتید، تشکیل دی کتوپیپرازین و … قرار داده نشوند. اگرچه امروزه روشهای سنتزی برای جلوگیری از چنین مشکلاتی وجود دارد. در صورتیکه یک اسیدآمینه غیرمعمول مانند D-آمینواسیدها در انتهای C وجود داشته باشد اضافه کردن گروه آمیدی در انتهای C توصیه می‌شود. اگر مدیفیکاسیونی (مانند بیوتین، فلورسین) در انتهای C وجود داشته باشد ترجیحا باید توسط زنجیره جانبی لایزین متصل شود.
آمینواسیدهای که ایجاد مشکل می کنند:
تعدادی از آمینواسیدهای شامل پرولین (ایزومریزاسیون سیس و ترانس)، آسپارتیک اسید (تشکیل آسپارتیماید)، گلاسین (پیوند هیدروژنی و تشکیل ژل) و سرین (مشکل جفت شدن) باید در توالی اجتناب شود. همچنین نباید بیش از 10 آمینواسید بعد از فسفوآمینواسید از سمت انتهای C قرار گیرد.
حلالیت پپتید
در طی مدت طراحی توالی توجه به حلالیت پپتید با احتساب تعدادی از اسیدهای آمینه باردار در پپتید از جمله انتهای N و C غیربلوکه. معمولا حداقل یک بار برای هر 5 اسیدآمینه حلالیت را بهبود می‌دهد. اطمینان از وجود نداشتن امتداد طولانی (بیش از 5 آمینواسید) از باقیماندهای بدون بار. توالی کوتاهی با باقیماندهای بسیار آبدوست باعث مشکلاتی در طی خالص سازی شده بطوریکه ممکن است روی ستون HPLC بخوبی حفظ نشود.