توالی یابی پروتئینها با روش سنگر و ادمن

در سال 1935 فردریک سانگر برای اولین بار موفق به تعیین توالی آمینو اسیدهای هورمون پروتئینی انسولین شد. پروتئینی که مسیولیت تنظیم قند خون در انسان را دارد و نام آن با بیماری دیابت عجین شده است. برای سهولت فهم تعیین توالی پروتئین با روش سانگر ، توالی آمینواسیدهای پپتید زیر را ( که دارای تعداد آمینو اسیدهای کمی است) در نظر بگیرند

Aly-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly

در مرحله اول پس از آبکافت کامل ، بوسیله کروماتوگرافی ستونی که نوعی روش جداسازی ملکولها بر مبنای اندازه و شاخص های دیگر است، نوع آمینواسیدها را مشخص می کنند

در مرحله دوم از شناساگرهایی مانند فلوئورودی نیتروبنزن و دانسیل کلرید که با گروه آمین ترکیب شده و اجسام ثابتی را تشکیل می دهند، استفاده می کنند.این مواد با گروه آمین آزاد آمینو اسید انتهایی زنجیره پپتیدی ترکیب می شوند. در اثر آبکافت کامل دی ان ای- پپتید، تمام آمینو اسیدها به صورت دو یونی آزاد شده و تنها آمینو اسید انتهایی به دلیل ترکیب با فلوئورودی نیتروبنزن به صورت غیر یونی آزاد می شود. در مرحله بعد ، آین آمینو اسید را با استفاده از حلال های آلی از مخلوط جدا کرده و سپس به روش کروماتوگرافی ستونی شناسایی می کنند.لازم به تذکر است که با این روش تنها آمینو اسید های انتهای آمینی قابل شناسایی خواهند بود

اگر آمینو اسید انتهایی زنجیره دارای گروه کربوکسیل آزاد باشد، این گروه بوسیله شناساگر شیمیایی لیتیم بوروهیدرات احیا مش شود، تا گروه کربوکسیل به گروه الکلی تبدیل شود.به صورت یک الکل آمین دار ، سپس پپتید را آبکافت می کنند تا آمینواسیدی که در اخر زنجیره و دارای گروه کربوکسیل بوده ، به صورت یک الکل آمین دار ، آزاد و شناسایی شود.علاوه بر واکنش بالا ، گروه کربوکسیل نیز می تواند با هیدرازین ترکیب شود و آمینوآسیل هیدرازید تولید کند

تعیین توالی پروتئین با روش ادمن

در این روش از فنیل ایزوسیانات به عنوان ملکول ترکیب شونده با گروه آمین آزاد استفاده می شود و ملکول حاصل یک مشتق فنیل تیوبامیل است، که پس از آبکافت یا تجزیه می توان نوع آمینو اسید را مشخص کرد.برتری این روش در این است که می توان از انتهای زنجیره پلی پپتید شروع کرد و هر یک از آمینواسیدها را یک به یک و به ترتیب جدا و شناسایی کرد.در صورت نیاز به تعیین توالی آمینو اسیدی داخلی ، تجزیه رشته پلی پپتیدی با استفاده از هضم آنزیمی ( مانند کیموتریپسین و تریپسین) انجام پذیر است

نظر به اینکه پیوند پپتیدی مورد اثر دو آنزیم ، برای مثال تریپسین، متفاوت است حاصل تجزیه پپتید بزرگتر به وسیله دو آنزیم متفاوت، پپتیدهای کوچکتر متفاوت است .با تعیین توالی آمینواسید ها در پپتید های کوچکتر و مقایسه توالی آمینو اسید با یکدیگر، می توان توالی آمینو اسیدهای پپتید اولیه را تعیین و تاکید کرد.امروزه با استفاده از روش ادمن از دستگاهی به نام توالی یاب برای تعیین توالی آمینواسیدها در یک پروتئین استفاده می شود

فردریک سانگر برای اولین بار نوع و توالی آمینواسیدهای موجود در هورمون انسولین گاوی را مشخص و گزارش کرد. نامبرده با انجام تجربیات خود مشخص کرد که انسولین ، پروتئینی با وزن مولکولی 5700 دالتن و متشکل از دو زنجیره پلی پپتیدی است که زنجیره ی اول آن متشکل از 21 آمینو اسید و زنجیره ی دوم آن متشکل از 30 آمینو اسید است.این دو زنجیر به وسیله دو پیوند دی سولفیدی به یکدیگر متصل هستند، ضمن اینکه زنجیر اول نیز خود دارای یک پیوند دی سولفیدی درونی است

مرکز آموزش بیوانفورماتیک نصر

http://genetics88band.blogfa.com/post/486 با اقتباس از

error: Content is protected !!
X